2.
VALUTAZIONE DELLE POTENZIALITA' PREDITTIVE DI AUTODOCK 4

Docking di Imatinib Mesilato (IM) all'interno del sito catalitico del dominio tirosin-chinasico di ABL umano e valutazione dei complessi di interazione

Fase 1.



LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA E FARMACI DI NUOVA GENERAZIONE

La Leucemia Mieloide Cronica (LMC) è una grave affezione neoplastica che colpisce le cellule progenitrici della linea mieloide ed in particolare la linea cellulare che porta alla formazione dei granulociti, un tipo di globuli bianchi (1), con conseguente blocco del loro differenziamento ed incremento del numero di queste cellule immature nel midollo osseo, nel sangue periferico ed in altri organi e tessuti (2). Osservata per la prima volta nel 1845 da Bennet, Virchow e Craige, la LMC è stata la prima malattia umana a essere collegata ad una singola anomalia genetica acquisita. Le cellule affette sono infatti citogeneticamente caratterizzate dalla presenza, nel loro nucleo, di un cromosoma anomalo, detto “Philadelphia”, dal nome della città americana dove fu osservato per la prima volta. E' proprio a livello di questo cromosoma che viene a costituirsi il gene chimerico BCR-ABL, principale responsabile della patologia. Questo gene codifica infatti per l'onco-proteina leucemica BCR-ABL che, da un punto di vista biochimico, presenta una funzionalità catalitica tirosin-chinasica costitutivamente attiva e refrattaria nei confronti dei diversi meccanismi di regolazione, normalmente messi in atto dalla cellula (3). Dal punto di vista biologico questo si traduce da una parte, in un aumento del segnale di crescita e proliferazione delle cellule leucemiche e, dall'altra, in una concomitante riduzione del segnale di morte cellulare (apoptosi) delle stesse, fattori che conducono alla trasformazione neoplastica. La LMC rappresenta il 20% di tutte le leucemie degli adulti ed il 4% delle leucemie infantili. La sua incidenza aumenta con l’età, passando da 1 caso su 1.000.000 in bambini nella prima decade di vita, 1 caso su 100.000 in individui intorno ai 40 anni (età media della diagnosi), arrivando fino a 1 caso ogni 10.000 dopo gli 80 anni di età. In pazienti senza trattamento clinico, la malattia procede generalmente attraverso tre diverse fasi:

Fase cronica. Presenta una situazione stabile e può persistere, in maniera variabile, da 3 a 5 anni. La progressione verso la fase successiva è subdola poiché, generalmente, non accompagnata da specifica sintomatologia in grado di compromettere la normale vita del paziente. A livello cellulare esiste ancora una debole capacità differenziativa dei precursori della linea mieloide accompagnata da una concomitante proliferazione di queste cellule, non più soggetta a controllo. Il passaggio alla fase successiva sembra richiedere, a livello molecolare, ulteriori modificazioni genetiche e/o epigenetiche, ancora non molto chiare.

Fase accelerata. Comincia ad insorgere una sintomatologia più marcata e, nel giro di pochi mesi, si registra un netto peggioramento di tutti i parametri clinici ed ematologici.

Fase blastica. Anche detta fase terminale della malattia, in questo stadio la malattia non è più distinguibile da una leucemia acuta e diventa fatale nel giro di 3-6 mesi. Il paziente mostra adesso una completa assenza di risposta alle più comuni terapie.

Per oltre un secolo, lo scopo principale dei trattamenti utilizzati nella cura della LMC, è stato quello di cercare di contenere la cosidetta massa leucemica. I pazienti venivano generalmente sottoposti a trattamento con chemioterapici convenzionali non specifici come: Busulfano (un agente alchilante del DNA) ed Idrossiurea (un agente ad azione antiproliferativa), che portavano ad un miglioramento nella conta dei cloni leucemici nel sangue periferico e dei sintomi correlati alla patologia, ma non erano tuttavia in grado di contenere, in modo sostanziale, la progressione della malattia e di migliorare le prospettive di vita del paziente. I pazienti trattati lamentano diversi effetti collaterali che comprendono: disturbi gastrointestinali, nausea, vomito, anemia, tendenza a sviluppare ecchimosi, emorragie e accresciuto rischio di sviluppare infezioni. Migliori risposte cliniche, specie nei tumori di tipo ematologico, sono state osservate utilizzando dell’Interferone alpha (IFN-α), proteina con attività immuno-modulatrice, naturalmente prodotta dall’organismo in risposta ad un attacco virale e che possiede spiccate proprietà anti-proliferative che ne rendono possibile l’impiego nella terapia tumorale, specie nel trattamento della LMC. A partire dai primi anni ’80, la terapia convenzionale fu infatti ridimensionata dall’uso dell’IFN-α, che si mostrò in grado di indurre una remissione ematologica completa nel 20-30% dei pazienti trattati, ma anche una risposta citogenetica duratura, migliorando le prospettive di sopravvivenza dei pazienti con un mantenimento dei risultati a lungo termine (4, 5). In pazienti con LMC questa divenne addirittura la prima terapia farmacologia alternativa al trapianto allogenico di midollo osseo. L’IFN-α, tuttavia, si rivelò una terapia con non trascurabili effetti collaterali mostrando una tossicità acuta ed una cronica, con tutta una serie di complicanze che, in alcuni casi, richiedono una inevitabile interruzione del trattamento.

Le conoscenze secondo le quali, l’espressione dell’oncogene chimerico BCR-ABL è responsabile della patogenesi della LMC e che l’alterata attività tirosin-chinasica dell’oncoproteina leucemica che ne deriva è ritenuta indispensabile per indurre la trasformazione neoplastica, hanno fatto del dominio tirosin-chinasico di ABL il target principale per lo studio di nuove terapie d’intervento. L’inibizione di questa attività si mostrò quindi una interessante strategia per il trattamento della malattia e portò, ben presto, allo sviluppo delle prime terapie molecolari mirate, specificatamente volte a reprimere il clone tumorale leucemico, intervenendo questa volta sulla specifica causa molecolare (6). La storia comincia nel 2001, quando, dopo anni di studi condotti su diversi fronti, la Novartis Institutes for Biomedical Research rende disponibile l’Imatinib Mesilato (IM), noto in europa con il nome commerciale di Glivec©. Imatinib è stato creato partendo da preliminari studi struttura/funzione, condotti sulla base delle attuali conoscenze del dominio tirosin-chinasico di ABL a livello atomico. Diverse analisi hanno consentito di ottimizzare l’iniziale composto guida, la 2-fenilamminopiridina, fino ad ottenere un composto in grado di inibire, con elevata efficacia, il funzionamento del dominio tirosin-chinasico di BCR-ABL (7, 8), inducendo una apoptosi selettiva delle cellule BCR-ABL positive, strettamente dipendenti dalla funzionalità di tale proteina.

Struttura chimica bidimensionale di Imatinib Mesilato

IM può considerarsi un farmaco selettivo, semi-specifico. Dati riportati in letteratura illustrano infatti la sua capacità di inibire, oltre il dominio tirosin-chinasico di ABL (e quindi di BCR-ABL), anche quello delle proteine: ARG (ABL Related Gene), PDGF-R (Platelet Derived Growth Factor Receptor) e c-KIT (Stem Cell Factor Receptor). Recentemente, sono state cristallograficamente risolte altre due proteine ad attività chinasica in grado di legare stabilmente IM: SYC [PDB code: 1XBB, anno 2004] e LCK [PDB code: 2PLO, anno 2007].

Il suo meccanismo d’azione è relativamente semplice, IM “compete” con l’adenosintrifosfato (ATP), substrato fisiologico normalmente utilizzato durante il processo di fosforilazione, per lo stesso sito all’interno della proteina. IM non può però considerarsi un vero competitore dell’ATP. Ottenuta la struttura cristallografica del dominio tirosin-chinasico di ABL complessato con IM, si notò che il farmaco lega il dominio catalitico, esclusivamente nella sua conformazione inattiva, formando una serie di interazioni di natura elettrostatica che stabilizzano fortemente il complesso. Il farmaco modifica in questo modo l’equilibrio esistente tra la conformazione attiva ed inattiva della proteina, spostando gradualmente questo equilibrio verso una crescente concentrazione della proteina a conformazione inattiva, incapace di legare fisiologicamente l’ATP. L’inibizione dell'attività tirosin-chinasica di BCR-ABL causa l’arresto del processo di fosforilazione e, conseguentemente, della trasduzione di tutti i segnali a valle, innescati, in maniera impropria, da questa oncoproteina.

L’impatto di questa scoperta sulla terapia fu profondo ed i risultati dei trattamenti iniziali rilevarono la superiorità dell’IM sull’IFN-α in termini non solo di tollerabilità, ma anche di completa risposta ematologica e citogenetica migliorando, in maniera sostanziale, le prospettive di vita del paziente e cambiando radicalmente la storia naturale della malattia (9). Il farmaco, considerato il capostipite dei cosiddetti “farmaci a bersaglio molecolare”, è diventato, di fatto, la terapia d’elezione nel trattamento dei pazienti di nuova diagnosi LMC. IM induce una ottima remissione citogenetica (circa il 68%) in più dell’80% dei pazienti in fase cronica, rispetto al 20-30% ottenuto con IFN-α da solo o associato con chemioterapici. Pazienti in stati più avanzati della malattia rispondono altresì ad IM, ma la remissione è molto meno frequente e il trattamento meno duraturo. Altri vantaggi non trascurabili riguardano la somministrazione orale del farmaco, sicuramente più agevole per il paziente in cura e la vasta tollerabilità, con conseguente riduzione degli effetti collaterali e diminuzione dei casi di sospensione della terapia.

Nonostante la sua grande efficacia, anche IM presenta alcuni importanti limiti. La straordinaria selettività, che ha fatto la fortuna di questo farmaco è infatti, al tempo stesso, anche il suo punto debole. Circa due pazienti su dieci non rispondono alla terapia o diventano resistenti al farmaco durante il periodo di trattamento, secondo meccanismi non ancora del tutto chiariti. Una spiegazione potrebbe essere quella secondo la quale, la cellula tumorale, geneticamente molto instabile, modifica in maniera casuale il suo DNA. Infatti, nella maggior parte dei casi, la resistenza al farmaco viene acquisita in seguito alla comparsa di punti di mutazione proprio a livello di particolari regioni del dominio tirosin-chinasico di BCR-ABL che ne alterano la struttura facendo si che il bersaglio sia riconosciuto con limitata efficacia o non sia più riconosciuto dal farmaco, rendendo il paziente resistente. Altri meccanismi di resistenza sembrano essere dovuti all’amplificazione del gene codificante per BCR-ABL, ad alti livelli plasmatici di AGP (Alpha1-acid Glyco Protein) che, legandosi ad IM, limita la sua capacità inibitoria nei confronti del dominio tirosin-chinasico di BCR-ABL e ridotto accumulo di IM all’interno della cellula.

La progettazione di farmaci con questo meccanismo d’azione è stato un vero passo in avanti nella conoscenza del cancro e potrebbe ancora rivoluzionare le modalità con cui attualmente esso viene curato. Altre forme farmacologiche alternative sono state progettate, o sono in corso di progettazione, per cercare di vincere le diverse forme di resistenza all’IM osservate in molti pazienti: Nilotinib (Tasigna©, Novartis) (10) e Dasatinib (Spricell©, Bristol-Myers Squibb) (11) sono soltanto due esempi. Un ulteriore problema riguarda i tempi di creazione e l’elevatissimo costo che lo sviluppo di questi farmaci impone: si stima che occorrono in genere 5/6 anni e da 500.000.000$ a 800.000.000$ per svilupparne uno.

SCOPO DEL LAVORO

Un metodo di Docking può essere considerato valido se è in grado di riprodurre il dato sperimentale relativo ad un complesso cristallograficamente risolto. Gli obbiettivi di questo lavoro sono stati quelli di collaudare e valutare le potenzialità predittive del programma di Docking AutoDock 4 nel riprodurre uno specifico dato cristallografico, partendo da una situazione in cui è sperimentalmente nota la posizione assunta dal ligando all’interno del sito catalitico dell’enzima. A tale scopo abbiamo utilizzato il dominio tirosin-chinasico della proteina ABL umana come struttura macromolecolare e l’inibitore Imatinib Mesilato come ligando da posizionare all’interno del sito catalitico del dominio in questione. Le due strutture sono state ottenute dal file di coordinate atomiche relativo al complesso cristallograficamente risolto dalla Novartis Institutes for Biomedical Research nel 2007 e reperibile presso l'archivio Protein Data Bank (PDB) con il seguente ID: 2HYY.

PREPARAZIONE DELLE MOLECOLE

Dopo aver separato la componente proteica dal ligando, le molecole subiscono generalmente una serie di modifiche preparatorie alla procedura di Molecular Docking: è sempre necessaria una minuziosa analisi della componente proteica allo scopo di evidenziare eventuali residui mancanti e/o incompleti, una eventuale eliminazione delle molecole di solvente e di ioni non complessati, l'aggiunta degli atomi di idrogeno, il calcolo delle cariche elettriche, minimizzazione energetica etc.

Tutti i calcoli di Docking e le relative analisi dei risultati sono stati condotti su un calcolatore dotato di CPU Intel Pentium4-HT da 3,20 GHz, 1,5 GB di RAM con sistema GNU/Linux UBUNTU 7.04 (Kernel 2.6.20-17).

Per limitare i complessi calcoli computazionali previsti, il nostro studio di Docking considera la proteina come una struttura rigida mentre il ligando come una struttura flessibile, fattore che potrebbe migliorare l’interazione con il sito attivo dalla proteina.

VALUTAZIONE CHIMICO-FISICA E VALUTAZIONE STRUTTURALE DEI COMPLESSI DI INTERAZIONE

I risultati, riferiti a 100 cicli di docking effettuati con il metodo AutoDock 4, sono contenuti all’interno di un file di log chiamato: Key_lock.dlg. Questi risultati sono stati valutati considerando principalmente tre parametri: 1] La minima energia libera di interazione (ΔG), 2] La Root Mean Square Deviation (RMSD), che definisce, in termini matematici, di quanto il nostro modello computazionale si discosta dal modello reale, 3] La costante di inibizione (Ki), che rappresenta la misura dell'affinità che il nostro inibitore ha per la proteina target, aspetto molto importante in questo tipo di studi.

Per ognuno dei 100 cicli di Docking otteniamo la posa che rappresenta la migliore soluzione trovata in quello specifico ciclo. Le 100 pose totali vengono quindi raggruppate in clusters secondo una specifica somiglianza strutturale in riferimento ad un preciso intervallo di RMSD. Considerando un intervallo di 2Å, le pose predette si distribuiscono all’interno di 8 clusters, ben 54 pose si trovano all’interno del primo, quello ad energia più bassa. Questa convergenza dei dati strutturali mostra come, da un punto di vista statistico, il programma abbia ottenuto una notevole quantità di buone soluzioni, tutte vicine da un punto di vista energetico e strutturale. La migliore posa assoluta predetta nei 100 cicli di Docking, si trova quindi all’interno di questo primo cluster e presenta una energia libera di interazione ΔG di -15,29 Kcal/mol con un valore di RMSD, rispetto alla posa sperimentale, di 0.35 Å ed una costante di inibizione Ki di 6,21 pMol (0,00621 nMol).

Istogramma relativo ai clusters creati sulla base di un intervallo RMSD di 2Å. In basso a sinistra le migliori pose assunte dal ligando per ogni singolo cluster ottenuto, per un totale di 8 pose. In basso a destra la migliore posa assoluta (viola), riferita al cluster 1

La Figura in basso mostra in detaglio la sovraposizione strutturale tra la molecola di IM sperimentale (verde), posizionata all'interno del sito catalitico del dominio tirosion-chinasico di ABL umano, e la migliore posa generata da AutoDock 4 (viola). L’immagine evidenzia una correta predizione relativa al posizionamento del farmaco ma anche una straordinaria somiglianza con la struttura reale in termini di torsioni, rotazioni e traslazioni interne. Il farmaco è posizionato all’interno della tasca tra il C-Lobe e l’N-Lobe del dominio tirosin-chinasico di ABL, attraversando la regione centrale del dominio da un lato all’altro. I grupi più a sinistra, che corrispondonno agli anelli aromatici di piridina e pirimidina occupano la regione che viene fisiologicamente occupata dall’adenina dell’ATP. Il resto del composto si estende verso la regione compresa tra l’A-loop in conformazine chiusa e l’elica-C.

Una analisi comparativa delle pose predette contenute nel primo cluster, mostra come l’IM mantiene una correta disposizione in un gran numero di queste pose, presentando piccole variazioni conformazionali nella parte relativa al grupo piridinico e pirimidinico, mentre la parte finale del farmaco, quella più esposta verso l’esterno della tasca catalitica, mostra notevoli variazioni tra le pose sia di tipo traslazionale che rotazionale. Questa condizione è dovuta al fatto che questa parte, più esposta al solvente, presenta una più elevata libertà di movimento.

La figura riportata a lato mostra un dettaglio della superficie accessibile al solvente del dominio tirosin-chinasico di ABL. Questo particolare tipo di rappresentazione, calcolata secondo l’algoritmo di Cannolly, evidenzia contemporaneamente anche la localizzazione delle regioni idrofobiche della proteina, utilizzando i valori forniti dalla scala Kyte e Doolittle. La gamma di colori va dal blu, per i residui più idrofilici, passando per il bianco, residui neutri, fino all'arancio-rosso per i residui più idrofobici come ad esempio: A, F, I, L, M, P, V, W. La tasca catalitica del dominio evidenzia un marcato caratere idrofobico ed è quindi colorata in rosso.

IMATINIB ALL'INTERNO DEL DOMINIO TIROSIN-CHINASICO DI ABL (VIDEO)

Il video mostra una panoramica della superficie del dominio tirosin-chinasico di ABL. Apprezzabile lo straordinario posizionamento del farmaco IM all'interno della tasca catalitica del dominio.

ANALISI DELLE INTERAZIONI ELETTROSTATICHE TRA IM E SITO CATALITICO

L’ATP forma 4 legami idrogeno con atomi dello scheletro proteico, all’interno del sito catalitico di ABL (12). IM forma invece 6 legami idrogeno e diverse interazioni di tipo Van der Waals per un totale di 21 interazioni elettrostatiche riportate in letteratura, mostrando così un eccezionale livello di complementarietà di superficie, rispetto al substrato fisiologico. Le interazioni di Van der Waals, principalmente di tipo idrofobico, coinvolgono i seguenti residui: L248, Y253, V256, A269, K271, E286, V299, I313, F317, L370, D381, F382, mentre i legami idrogeno, coinvolgono i residui E286, T315, M318, I360, H361, ed A380.

L’azoto del grupo piridinico dell’IM forma un legame idrogeno con il backbone della M318. L’N13 forma un legame idrogeno con l’ossigeno della catena laterale del T315. L’N21 forma un legame idrogeno con l’ossigeno della catena laterale del E286. L’O29 del farmaco forma un legame idrogeno con il backbone del residuo A380, che precede il motivo DFG dell’activation loop. L’N51, all’interno del grupo metil-piperazinico dell’IM, forma legami idrogeno, a livello del backbone, con due residui: la I360 e l’H361.

La figura in basso mostra un’analisi delle interazioni elettrostatiche del farmaco all'interno del sito attivo, facendo riferimento esclusivamente ai legami idrogeno. L’analisi è stata effettuata utilizando il software UCSF Chimera e condota sia sul complesso sperimentale che sul complesso predetto da AutoDock 4. Il software è stato in grado di riconoscere ed evidenziare correttamente 5 dei 6 legami idrogeno riportati in letteratura, sia sul complesso sperimentale che sul complesso predetto, fattore che enfatizza il fatto di aver predetto la corretta disposizione del farmaco all'interno del sito attivo. Soltanto il legame idrogeno con il residuo H361 non è stato infatti evidenziato in entrambi i casi.

Analisi comparativa delle interazioni elettrostatiche del farmaco all'interno del sito attivo. Sono evidenziati esclusivamente i residui aminoacidici coinvolti nei legami idrogeno con il farmaco, il resto della proteina e gli atomi di idrogeno sono stati omessi per chiarezza

CONCLUSIONI

Attualmente il Docking Molecolare è una tecnica giunta a maturità, ma ancora lontana dalla perfezione. Gli algoritmi di ricerca riesconno a predire, con discreta accuratezza, l’esatta conformazione strutturale del complesso Proteina-Ligando raggiungendo un percentuale di sucesso intorno al 70-80% (13), ma diverse approssimazioni sono ancora oggi necessarie. È evidente che il lavoro illustrato in questa sezione debba essere considerato ampiamente preliminare. Infatti, una sola applicazione è analiticamente insuficiente per valutare appieno le potenzialità positive e/o le carenze del metodo AutoDock 4. Possiamo però concludere dicendo che, almeno nel presente caso di studio, AutoDock 4 si è rivelato uno strumento valido, efficiente e in grado di riprodurre con gran precisione il dato sperimentale.

REFERENZE BIBLIOGRAFICHE:

  1. Ruibao R. Mechanisms of Bcr-ABl in the pathogenesis of chronic myelogenous leukaemia. Nature Reviews 2005; 5:172-183
  2. Geary C.G. The story of chronic myeloid leukaemia. Br J Haematol. 2000; 110:2-11.
  3. Deininger M.V., Goldman J.M. and Melo J.V. The molecular biology of chronic myeloid leucemia. Blood 2000; 96:3343-56
  4. Arana-Trejo RM, et al. Interferon in the eradication of the Philadelphia chromosome in chronic myeloid leukemia. Rev Invest Clin. 1997; 49:209-14.
  5. Robak T. Interferon alpha in the treatment of chronic myelogenous leukemia. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 1998; 46:347-53.
  6. Kantarjian H et all. Survival advantage with imatinib mesylate therapy in chronic-phase chronic myelogenous Leukemia (CML-CP) after IFN-alpha failure and in late CML-CP, comparison with historical controls. MClin Cancer Res. 2004; 1:68-75.
  7. Druker BJ, Tamura S, Buchdunger E, et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nat Med 1996; 2:561-566.
  8. Schindler T, Bornmann W, Pellicena P, Miller WT, Clarkson B, Kuriyan J. Structural mechanism for STI-571 inhibition of abelson tyrosine kinase. Science 2000; 289(5486):1938-1942.
  9. Angstreich GR, Smith BD, Jones RJ. Treatment options for chronic myeloid leukemia: Imatinib versus interferon versus allogeneic transplant. Curr Opin Oncol. 2004; 16:95-99.
  10. Quintas-Cardama A, Cortes J. Nilotinib therapy in chronic myelogenous leukemia. Drugs Today (Barc). 2007; 43:691-702
  11. Steinberg M. Dasatinib: a tyrosine kinase inhibitor for the treatment of chronic myelogenous leukemia and philadelphia chromosome-positive acute lymphoblastic leukemia. Clin Ther. 2007; 29:2289-308.
  12. Nagar B et al. Crystal Structures of the Kinase Domain of c-Abl in Complex with the Small Molecule Inhibitors PD173955 and Imatinib (STI-571). Cancer Research 2002; 62:4236–4243.
  13. Bursulaya BD, Totrov M, Abagyan R, Brooks CL III. Comparative study of several algorithms for flexible ligand docking. J Comp Aided Mol 2003; 17:755–763.

[Torna su]